2019年12月，由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发的新冠肺炎（COVID-19）疫情爆发，随后在短短两个月内便席卷全球，成为全球性大流行疾病。而与此同时，关于新冠病毒疫苗和抗体的研发工作也在以史无前例的速度开展，这其中即需要大量的资金支持，也需要诸多新技术新方法的应用。本期，笔者就为大家总结了在新冠肺炎疫情期间，单克隆中和抗体的分离和鉴定都使用了哪些技术方法？

SARS感染者来源抗体

2020年5月18日，Nature杂志发表文章：Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody，报告分离了来自于SARS感染者的单克隆抗体，能够有效结合SARS-CoV-2病毒。研究团队分别使用在2004年和2013年从患者采集的外周血单核细胞进行了记忆B细胞筛选。从eb病毒永生化记忆B细胞中，共分离出25个单克隆抗体，其中有8个与表达SARS-CoV-2 S糖蛋白或SARS-CoV S糖蛋白的CHO细胞结合。并且其中一个S309抗体还增加了LS突变，延长了其半衰期。

值得一提的是，在新冠肺炎疫情期间，复旦大学应天雷团队首次发现一个来自于SARS-CoV感染患者的单克隆抗体CR3022也可以与SARS-CoV-2 的RBD结合，因此也被认为可以单独或与其他抗体联合采用鸡尾酒疗法，用于预防和治疗新冠肺炎。

人源化小鼠平台

2020年6月15日，Science杂志发表了再生元公司的一篇文章：Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail，研究使用了来自人源化小鼠（VelocImmune® (VI)）以及康复者血清。用表达SARS-CoV-2 S蛋白的DNA质粒免疫VI小鼠，然后用由SARS-CoV-2 RBD组成的重组蛋白进行加强免疫。VI小鼠在免疫后引发针对SARS-CoV-2 S蛋白的强大免疫反应。在最后一次加强免疫后7天收集的小鼠血浆滴度通过ELISA确定，滴度最高的小鼠用于抗体分离。对这些小鼠的脾脏进行生物素标记的单体RBD抗原染色，并进行流式分选。

为了评估抗原特异性应答，从VI小鼠和人来源的B细胞中克隆了自然配对的重链和轻链cDNAs，并将其转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，以产生重组的全人源抗体。含有抗体的上清液被高通量筛选与RBD蛋白结合的抗体，分离出大量具有不同序列、结合特性和抗病毒活性的单克隆抗体。

在另一篇文章中，研究人员也采用了H2L2全人源小鼠平台，其编码具有人可变区重链和轻链以及大鼠来源恒定区的嵌合免疫球蛋白。用传统的杂交瘤方法分离并评估了51种SARS-CoV S蛋白抗体的ELISA交叉反应性。发现51种SARS-S杂交瘤上清液中有4种显示出与SARS-CoV-2 S蛋白亚基的ELISA交叉反应，其中一种47D11还同时表现出抗SARS-S和SARS2-S的交叉中和活性。

驼源纳米抗体VHH

在骆驼科动物体内，存在一种天然的缺失轻链的重链抗体——单域抗体（VHH），也称纳米抗体（Nanobody）。因其易于表达，可溶性高，尺寸小，抗原结合特性好和耐热稳定性高，越来越受到研究者们的青睐。2020年6月11日，Cell杂志发表了一篇分离自美洲驼的单域抗体VHHs，该研究对美洲驼先后使用SARS-CoV-1 S蛋白和MERS-CoV S蛋白进行了2次皮下免疫，接着再一次使用SARS-CoV-1 S蛋白免疫，最后同时使用SARS-CoV-1和MERS-CoV S蛋白进行免疫。最终接种了多次SARS-CoV-1和MERS-CoV 的S蛋白后的骆驼免疫产生出7种抗MERS-CoV和5种抗SARS-CoV-1的单域抗体。

然而，驼源的纳米抗体，即使人源化后仍然含有一定的驼源成分，在人体中使用时往往存在安全性隐患。因此，复旦大学应天雷团队将全人源的重链可变区抗体骨架进行筛选重构，从而首次设计出基于天然胚系基因的全人源纳米抗体库。并以 SARS-CoV-2 的 RBD 结构域和 S1 蛋白为抗原，在抗体库中筛选出了靶向多类表位的纳米抗体。从而开发了一个用于快速分离人源纳米抗体的通用平台。

新冠肺炎患者PBMCs分离单克隆抗体

来源于新冠肺炎患者外周血单核细胞（PBMCs）的单克隆抗体是目前最重要的治疗性单克隆抗体来源。2020年5月13日，中国科学院高福院士等团队在Science杂志发表论文：A noncompeting pair of human neutralizing antibodies block COVID-19 virus binding to its receptor ACE2，该研究以新冠病毒RBD蛋白为诱饵，从COVID-19患者PBMCs中分离出特异性单个记忆B细胞。分别从单个B细胞中扩增出抗体轻重链的可变区域，然后克隆到含有恒定区域的pCAGGS载体中并转染细胞，产生出一系列IgG1抗体。

利用生物层干涉法（BLI）筛选上清液，使其与RBD蛋白结合。分选出4种单克隆抗体（B5、B38、H2和H4）可有效与新冠病毒RBD蛋白结合。其解离常数(Kd)范围为107 ~ 109 M，IC50值为0.177 μg/ml ~ 1.375 μg/ml之间。同时，将抗体B38和H4联合使用发现，即使存在较高滴度的病毒，也能表现出协同效应。

此外，中科院微生物研究所严景华研究员团队也以同样方法分离出一种新冠病毒单克隆中和抗体CB6，并且首次使用非人灵长类动物——恒河猴进行动物实验，证实了该抗体能有效阻断新冠病毒与ACE2结合，目前也已进入临床试验。

单细胞测序助力抗体筛选

而随着PBMCs来源的单克隆中和抗体分离方法的广泛应用，一些最新技术也一定程度上加速了抗体的分离和鉴定工作。如2020年5月18日，北京大学谢晓亮团队在Cell杂志发文：Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients’ B cells。

该研究利用最先进的高通量单细胞RNA和VDJ测序技术，用不到三个月的时间，从康复期病人的血液中成功筛选到了针对新冠肺炎病毒的中和性抗体，并开展了临床前的动物实验，结果显示该抗体分子能够非常有效地抑制和短期预防新冠病毒的感染。同时也证明了通过高通量单个B细胞测序技术可有效地发现人源中和单克隆抗体，以应对大流行性传染病。

综上，我们这次在应对新冠肺炎疫情的工作上明显要比过去面对SARS和MERS时期更成熟更有经验的多。截至目前，全球已获得了超过90种新冠病毒单克隆中和抗体，其中4种已进入了临床试验。而在疫苗研发方面，全球也已有18种候选疫苗进入临床试验阶段，128种疫苗处于pre-clinical状态。相信随着科技的进步，在将来我们还会有更多创新性的技术问世，人类终将战胜病毒疫情。

参考文献：

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